![\"\"](\"http:\/\/www.nosoinfo.be\/nosoinfos\/wp-content\/uploads\/2021\/02\/9345-750x500.jpg\")
<\/p>\n<\/p>\n
Sinds 2006 staat het Belgisch Nationaal Referentiecentrum Clostridium difficile<\/i> (CD) in voor de epidemiologische opvolging van door Clostridium difficile<\/i> (CDI) veroorzaakte infecties en dit in het kader van de door Sciensano georganiseerde surveillanceprogramma\u2019s. Tot 2014 was deelname aan de surveillance voor de ziekenhuizen verplicht, sindsdien gebeurt dit vrijwillig.<\/p>\n
Minstens \u00e9\u00e9n semester per jaar sturen de deelnemende ziekenhuizen vijf opeenvolgende stammen naar het NRC voor ribotypering. Eventueel kunnen ook de genetische mechanismen van virulentie en antibioticagevoeligheid worden bepaald. Tussen 2006 en 2010 was de\u00a0 <\/span>ribotypering vooral gericht op het opvolgen van de evolutie van ribotype 027, gekenmerkt door een grote pathogeniteit als gevolg van een verhoogde toxineproductie. Deze stam was in veel landen, ook in Belgi\u00eb, verantwoordelijk voor veel ernstige epidemie\u00ebn met een hoge mortaliteit. De incidentie van deze stammen is geleidelijk afgenomen, waardoor andere en minder pathogene ribotypes meer op de voorgrond treden.<\/p>\n Tot nu toe zijn er meer dan 550 verschillende ribotypes van Clostridium difficile<\/i> ge\u00efdentificeerd. De gevallen van CDI zijn de laatste jaren endemisch geworden en er is relatief weinig bewijs van overdracht.\u00a0<\/span><\/p>\n Het NRC moet waakzaam blijven voor het mogelijke opduiken van andere ribotypes die een verhoogd risico met zich mee kunnen brengen, zoals ribotype 027. In de periode januari-juli 2018 werd een stam die behoort tot een nieuw ribotype RT181 (Belgische nomenclatuur 585) ge\u00efsoleerd uit 12 stoelgangmonsters van 5 pati\u00ebnten met een ongewoon ernstige kliniek.. We hebben deze stam op basis van het genotype en fenotype gekarakteriseerd. Er werd gezocht naar epidemiologische verbanden tussen deze verschillende pati\u00ebnten en naar mogelijke transmissies tussen pati\u00ebnten en ziekenhuizen.<\/p>\n De 12 stoelgangmonsters waren afkomstig van vijf pati\u00ebnten, van wie er vier in de Cliniques Universitaires Saint Luc (CUSL) en \u00e9\u00e9n in de Cliniques de l\u2019Europe (CDLE) waren gehospitaliseerd tussen maart en september 2018 (zie figuur 2). Deze stammen werden geanalyseerd met verschillende microbiologische methoden die hieronder kort worden beschreven.\u00a0<\/span><\/p>\n De ribotypering bestaat uit de analyse na extractie van bacterieel DNA en PCR-amplificatie van de intergenische gebieden die zich tussen de genen 16S rDNA en 23S rDNA bevinden. Hiervoor worden twee primers geselecteerd uit het goed bewaarde deel van het begin van het 16S rDNA-gen en het einde van het 23S rDNA-gen.\u00a0<\/span><\/p>\n Na amplificatie worden de door capillaire elektroforese verkregen fragmenten met behulp van computersoftware geanalyseerd en het stamprofiel gedefinieerd. Dit profiel zal worden vergeleken met een database met alle in het NRC aangetroffen ribotypes, om zo het ribotype van de stam te bepalen.<\/p>\n Een genotypering wordt uitgevoerd via een commerci\u00eble moleculaire test (GenoType Cdiff) op een strip (methode DNA-strip). Op die manier is de identificatie van C difficile<\/i> (detectie van het TPI-gen) en de bepaling van de virulentie ervan mogelijk door gelijktijdig de verschillende pathogeniteitsfactoren te karakteriseren, zoals de productie van de toxines A en B (tcd<\/i>A- en tcd<\/i>B-genen), van het binaire toxine (cdtA<\/i>– en cdt<\/i>B-genen), de detectie van mogelijke deleties op het tcdC-regulatiegen, en ook de moxifloxacineresistentie (mutaties op het gyr<\/i>A-gen).<\/p>\n Het zoeken naar een toxineproductie gebeurt via visualisatie van het cytopathologisch effect op MRC-5 cellen, een cellijn met menselijke embryonale fibroblasten. Bij een toxinogene stam wordt een cytopathologisch effect waargenomen. Dit effect wordt gekenmerkt door een afronding van degenererende cellen en hangt rechtstreeks samen met de aanwezigheid van vrij toxine B in het supernatant na 24 tot 48 uur incubatie.\u00a0<\/span><\/p>\n MLVA (Multi-Locus Variable number tandem repeat Analysis) is een andere typeringstechniek die gebaseerd is op de analyse van regio\u2019s in het C. difficile<\/i> genoom dat bestaat uit een opeenvolging van korte herhaalde nucleotidesequenties, genaamd \u2018VNTR\u2019 (Variable Number Tandem Repeat). Deze moleculaire biologietechniek kan ook een overeenkomst tussen genetisch verwante stammen blootleggen en geeft extra informatie over de ribotyperingstechniek.<\/p>\n Na de initi\u00eble PCR-amplificaties van de betrokken zones wordt in een volgende fase het aantal motiefherhalingen berekend op basis van de grootte, geschat door capillaire elektroforese, van de fragmenten van elke geamplificeerde locus.\u00a0<\/span><\/p>\n In vitro gevoeligheidstests werden uitgevoerd met behulp van de agar dic diffusiemethode of door bepaling van een MIC waarde via de E-test\u00ae methode voor de volgende antibiotica: metronidazole, vancomycine, moxifloxacine, rifampicine, erythromycine, clindamycine, tetracycline en chloramphenicol en dit volgens de EUCAST-normen.\u00a0<\/span><\/p>\n Het elektroforeseprofiel dat werd verkregen voor ribotype 585 (RT 181 in de internationale nomenclatuur) was nieuw en kwam niet overeen met een ander ribotyperingsprofiel dat al in de NRC-database werd herkend. Figuur 1 hieronder toont de mate van overeenkomst tussen ribotype 585 en 027. Hun respectieve profielen waren wel degelijk verschillend en ribotype 585 verschilde van ribotype 027 door de aanwezigheid van een extra strip van 280 basisparen en het schrappen van een andere strip van 370 basisparen.<\/p>\n Figuur 1: Elektroforeseprofielen van de ribotypes 027 en 585 <\/i><\/p>\n \n De MLVA-techniek bevestigde dat alle C. difficile<\/i> stammen met ribotype 585 een duidelijke klonale relatie vertoonden en dat ze verschilden van stammen die tot ribotype 027 behoren (Zie. figuur 2).\u00a0<\/span><\/p>\n Figuur 2: Phylogenetische boom gebaseerd op de MVLA typage \n \nDe genotypering op strip van stammen 585 (RT181) was vergelijkbaar met die van stammen 027 met twee deleties in het tcdC-gen en een moxifloxacineresistentie als gevolg van een specifieke mutatie in het gyrA-gen (Tabel 1).\u00a0<\/span><\/p>\n Tabel 1: Interpretaties van de bandes van de genotypering op DNA Strip \n Het antibiogram bevestigde een hoge mate van moxifloxacineresistentie en zeer vergelijkbare gevoeligheids- en resistentieprofielen tussen ribotype 027 en 585 (RT181) stammen. Deze laatste verschilden echter door de aanwezigheid van rifampicineresistentie (Tabel 2).<\/p>\n Tabel 2: Resultaten van de antibiotica-gevoeligheidstesten<\/i><\/p>\n <\/p>\n C. difficile<\/i> stammen 027 en 0585 leken ook sterk op elkaar wat betreft de toxineproductie en het cytopathogene karakter, hoewel ze iets minder uitgesproken zijn voor ribotype 585 (tabellen 3 en 4).\u00a0<\/span><\/p>\n Tabel 3: Resultaat van het cytopathogene effect van verschillende verdunningen van bacteriesuspensie<\/i><\/p>\n <\/p>\n \nTabel 4: Resultaten en chemiluminescentie-index van de LIAISON\u00ae XL\u00a0<\/span><\/i>Epidemiologische en klinische informatie\u00a0<\/i><\/p>\n \u00a0<\/p>\n \nTabel 5: Tijdlijn van de hospitalisaties<\/p>\n \n \nCUSL : Cliniques universitaires Saint-Luc<\/span> Tabel 6: Klinische informatie over pati\u00ebnten (dragers van stammen 585)<\/i><\/p>\n We rapporteren hier de microbiologische kenmerken van een kloon van epidemische stammen die behoren tot een nieuw ribotype (585 in de Belgische nomenclatuur; RT181 in de internationale nomenclatuur) en die een genotype vertonen dat dicht bij de hypervirulente stammen 027 aanleunt. Het genotype, de toxineproductie en de antibiogrammen geven aan dat de stammen 585 (RT181) hypervirulent zijn: ze produceren in verhoogde mate de toxines A en B, en het binaire toxine (aanwezigheid van de cdtA- en cdtB-genen), en ze hebben een mutatie in het tcdC-gen die de negatieve regulatie van de toxineproductie nadelig be\u00efnvloedt. Ze zijn ook resistent tegen dezelfde antibiotica als de hypervirulente stam 027 (vooral een hoog niveau fluorochinolonenresistentie door mutatie in het gyrA-gen) en bovendien resistent tegen rifampicine.\u00a0<\/span><\/p>\n De tijdslijn toont aan dat pati\u00ebnten 1 en 2 met hun C. difficile <\/i>585 (RT181) stam in de Cliniques universitaires Saint-Luc (CUSL) zijn aangekomen vanuit twee verschillende sites die deel uitmaken van dezelfde ziekenhuisgroep.<\/p>\n Een van de pati\u00ebnten (P1), die zeer ongedisciplineerd was en de aanbevolen isolatiemaatregelen niet respecteerde, was de oorzaak van een kleine cluster in de US 44 (interne geneeskunde).\u00a0 <\/span>Na het instellen van strenge bijkomende voorzorgsmaatregelen werd\u00a0 <\/span>dit soort ribotype gedurende de volgende maanden niet meer terug gevonden in CUSL. In het \u00abbron\u00bb-ziekenhuis daarentegen werd meer dan 6 maanden later nog een nieuwe pati\u00ebnt gevonden.<\/p>\n Uit klinische informatie (retrospectief verzameld), bleek dat pati\u00ebnten die een CDI veroorzaakt door stam 585 (RT181) hadden opgelopen, allen na een eerste behandeling, minstens \u00e9\u00e9n hervalepisode hebben gekend. De resultaten van de MLVA-analysetechniek doen een klonaal verband vermoeden tussen de stammen 585 (RT181) en dus ook een grote kans op overdracht tussen pati\u00ebnten. De verbanden en vermoedelijke transmissies zijn weergegeven in het hospitalisatieschema van pati\u00ebnten (zie tabel 5).\u00a0<\/span><\/p>\n Er werden bijkomende contactvoorzorgsmaatregelen getroffen en de pati\u00ebnten werden in een eenpersoonskamer opgenomen, zoals bij elke pati\u00ebnt met een CDI, aangezien het ribotype op het ogenblik van de infectie nog niet bekend was.\u00a0<\/span><\/p>\n Opgemerkt moet worden dat dit ribotype sindsdien niet meer is aangetroffen, terwijl ribotype 027 in 2019 goed was voor 1,3% van de stammen die het referentielaboratorium Clostridium difficile heeft ontvangen.<\/p>\n De hier beschreven technisch complexe en zeer dure analyses\u00a0 <\/span>voor de karakterisering van deze stam, met name\u00a0 <\/span>moleculaire typering in geval van een epidemie (cf. ribotypering, genotypering, MLVA, …) worden niet lokaal uitgevoerd maar enkel in gespecialiseerde laboratoria (de NRC). Ze zijn bovendien zeer tijdrovend. De resultaten van deze analyses zijn meestal pas enkele weken\/maanden later bekend en zijn alleen bedoeld om hypotheses over bronnen\/origines en overdrachtswegen te bevestigen\/ontkrachten. In geen geval mag worden gewacht tot de resultaten beschikbaar zijn om de aanwezigheid van een epidemie te melden en om preventie- of controlemaatregelen voor het voorkomen van transmissie in te stellen of te\u00a0 <\/span>versterken.<\/p>\n De aanbevelingen voor de beheersing van een Clostridium difficile<\/i>-epidemie staan beschreven op pagina 34 van advies 9345 van de Hoge Gezondheidsraad: Aanbevelingen voor de beheersing en preventie van clostridium difficile-infecties in zorginstellingen\u00a0<\/span><\/p>\nResultaten<\/b><\/h3>\n
![\"\"](\"http:\/\/www.nosoinfo.be\/nosoinfos\/wp-content\/uploads\/2021\/02\/c-difficile01-750x354.png\")
<\/p>\n
\n![\"\"](\"http:\/\/www.nosoinfo.be\/nosoinfos\/wp-content\/uploads\/2021\/02\/fig-NL-750x367.jpg\")
\n<\/i><\/p>\n
\n![\"\"](\"http:\/\/www.nosoinfo.be\/nosoinfos\/wp-content\/uploads\/2021\/02\/table2-NL-750x204.png\")
\n<\/i><\/p>\n![\"\"](\"http:\/\/www.nosoinfo.be\/nosoinfos\/wp-content\/uploads\/2021\/02\/c-difficile04A-750x488.png\")
<\/i><\/p>\n![\"\"](\"http:\/\/www.nosoinfo.be\/nosoinfos\/wp-content\/uploads\/2021\/02\/c-difficile05A-750x162.png\")
<\/i><\/p>\n![\"\"](\"http:\/\/www.nosoinfo.be\/nosoinfos\/wp-content\/uploads\/2021\/02\/c-difficile06-750x143.png\")
<\/i><\/p>\n![\"\"](\"http:\/\/www.nosoinfo.be\/nosoinfos\/wp-content\/uploads\/2021\/02\/c-difficile07-750x471.png\")
<\/p>\n
\nCDLE: Europa Ziekenhuizen<\/span>
\nSTE S -Elisabeth<\/span>
\nSTM: St Michiel<\/span>
\nCHA, Centrum hematologie volwassenen<\/span>
\nUS 33: Nefrologie, neurologie<\/span>
\nUS 43 en 44: Algemene interne geneeskunde<\/span>
\nUS 83: Oncologie<\/span>
\nP1: Pati\u00ebnt 1\u2026<\/span><\/p>\n![\"\"](\"http:\/\/www.nosoinfo.be\/nosoinfos\/wp-content\/uploads\/2021\/02\/table6-NL-750x415.png\")
<\/b><\/p>\nDiscussie<\/b><\/h3>\n